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本产品是一种在较高温度(65℃以上)时仍然保持活性的核糖核酸内切酶。本制品可以选择性识别并酶切RNA:DNA杂合双链中的RNA的磷酸二酯键，同时杂合双链中的DNA会保持完整。本制品不会降解单链或双链的RNA或DNA。

本产品在65℃以上温度时仍具有很高的酶活性，其在70℃时的半衰期可达几个小时，在高达95℃时的半衰期仍可达30分钟左右。该酶的耐高温特性使得异源双链RNA:DNA杂交分子具有更高的特异性，并在较高温度下更特异性地降解杂合双链中的RNA。Thermostable RNase H具有与常见的E.coli RNase H具有类似的酶学性质，但E.coli RNase H在高于55℃时即失活。

• 本产品与E.coli RNase H的热稳定性比较请参考图1。
  
  图1.本产品与E.coli RNase H的热稳定性比较。在20μL反应体系中加入图中指定量的Thermostable RNase H或E.coli RNase H，在65℃孵育20min后，Thermostable RNase H和E.coli RNase H分别按照其标准的反应条件(Thermostable RNase H 50℃孵育20min；E.coli RNase H 37℃孵育20min)进行RNA:DNA杂交链的酶切反应，反应完毕后立即冰浴3～5分钟并加入1μL 0.5M EDTA终止反应。取出5μL反应液，加入1μL 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(冰浴条件下180V电泳45min；之后用红色核酸染料（货号：YT015）室温染色15min，即可拍照观察结果)。如图所示，E.coli RNase H在65℃时失去活性，而Thermostable RNase H在65℃时仍保持活性。热稳定性比较反应体系(20μL)：
  
  • Thermostable RNase H：
    50mM Tris-HCl (pH8.3),75mM KCl,3mM MgCl₂,10mM DTT,400ng RNA:DNA杂合双链以及不同量的Thermostable RNase H (包括未经热处理和在65℃孵育20min热处理)，50℃孵育20min；
    
  • E.coli RNase H：
    20mM Tris-HCl (pH7.8),40mM KCl,8mM MgCl₂,1mM DTT,400ng RNA:DNA杂合双链以及不同量的E.coli RNase H (包括未经热处理和在65℃孵育20min热处理)，37℃孵育20min。
  
  
• 本产品催化降解RNA:DNA杂合双链中的RNA链的效果请参考图2：
  
  本产品和N公司的同类产品的效果比较图。使用本产品或竞品的Thermostable RNase H，在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或竞品，50℃孵育20min进行反应，反应完毕后立即冰浴3～5分钟并加入1μL 0.5M EDTA以终止反应。取出5μL反应液，加入1μL 6×DNA Loading Buffer，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(冰浴条件下180V电泳45min；之后用红色核酸染料（货号：YT015）室温染色15min，即可拍照观察结果)。如图所示，本制品与竞品相比，具有类似的催化效果。RNA:DNA杂合双链反应体系(20μL)：50mM Tris-HCl (pH8.3),75mM KCl,3mM MgCl₂,10mM DTT,400ng RNA:DNA杂合双链以及不同量的Thermostable RNase H，50℃孵育20min。

• 严谨的RNA结构图谱的描绘和位点特异性RNA切割；
  
• 与oligo (dT)杂交的mRNA的poly (A)尾的酶切去除；
  
• cDNA合成后去除mRNA；用于等温扩增实验；
  
• 用于和特定DNA序列杂交后酶切去除特定的RNA序列，例如rRNA的去除等。

组分	250U	1000U	5000U
Thermostable RNase H(5U/μL)	50μL	200μL	1mL
10×RNaseH Reaction Buffer	150μL	500μL	2mL

保存：-20℃，有效期一年。


10×RNaseH Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl (pH8.3 at 25℃),750mM KCl,30mM MgCl₂,100mM DTT。


50mM Tris-HCl (pH7.5),100mM NaCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,0.1% Triton X-100,50% (v/v) Glycerol。


大肠杆菌表达的重组蛋白。


One unit is defined as the amount of enzyme required to produce 1nmol of ribonucleotides from 40pmol of a fluorescently labeled 25 base pair RNA:DNA hybrid in a total reaction volume of 50μL in 20minutes at 50℃。


纯度大于95%，不含DNA内切酶和外切酶，不含其它核糖核酸酶。


加入适量蛋白酶K消化或加入5%体积的0.5M EDTA pH8.0。

• 本产品的最佳反应温度高于65℃，在95℃时仍具有活性，其在65℃时的活性是在37℃时的3～4倍。
  
• 本产品在使用说明中建议的反应温度是50℃，在实际实验操作中可以酌情通过提高反应温度提高其酶活性。
  
• 本产品的反应缓冲液中包含MgCl₂，当Thermostable RNase H在高温时应用于RNA/DNA杂交链或者RNA样品时，建议适当限制反应时间和温度，以减少金属介导的单链RNA降解。

• RNA/DNA杂合双链的退火。
  将单链RNA和DNA等摩尔数混合，推荐的终浓度为20μM，90℃孵育1min，然后通过梯度降温至25℃退火形成RNA:DNA杂交双链。推荐使用我公司的Annealing Buffer for RNA oligos (货号：YT529)，并按照该产品的使用说明进行退火反应。退火后的双链如果不立即用于后续的翻译，推荐在-80℃保存。
  
• 反应体系的设置。对于RNA:DNA杂合双链中的RNA链的降解，参考下表在冰浴中配制如下反应体系。
  

  成分	用量	终浓度
  DEPC-treated Water	(17-x)μl	-
  RNA:DNA hybrid	xμl	≤0.1μg/μL
  10×RNase H Reaction Buffer	2μL	1×
  Thermostable RNase H (5U/μL)	1μL	0.25U/μL
  Total Volume	20μL	-

  
  注意：
  
  • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。
    
  • 如果同时进行多个反应，可以把上表中除RNA:DNA杂合双链之外的所有溶液和酶提前混合，然后再分装到各反应管。
    
  • RNA:DNA杂合双链的用量可以是2μg或者更少。通常上述反应体系中的杂合双链的量不超过2μg，可以确保酶切充分。
  
  
• 酶切反应：50℃孵育20min。
  如果发现效果欠佳，可以根据杂合双链的稳定性尝试将反应温度提高至65℃或更高温度(65℃时的酶活性约是50℃时的3倍)，也可以考虑适当延长反应时间。对于去除总RNA的复杂RNA体系中的特定RNA的反应体系，酶切反应的温度可以适当摸索，例如适当提高酶切的温度，以确保更高的酶切特异性。
  
• 终止反应：反应结束后加入蛋白酶K或1μL 0.5M EDTA pH8.0，终止反应。

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